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MT0006 TaqMan microRNA反

北京百奥莱博科技有限公司
会员指数: 企业认证:

价格: 677.00¥

所在地:北京

型号:MT0006

手机:18518407031(微信同步)

电话:010-56109559

更新时间:2019-05-01

浏览次数:92

公司地址:北京市海淀区北玉河村500号

18518407031(微信同步)   王欣(女士)   (来电时请说是从仪器交易网看到我的)

产品简介

TaqMan microRNA反由北京百奥莱博供货并提供相关技术服务支持,本品用于科研目的,本品质量稳定,价位合理,需要TaqMan microRNA反等基因结构和功能产品的客户,请到我公司官网联系我们。

公司简介

北京百奥莱博科技有限公司是一家专业的生物试剂销售公司。公司主要经营血清、抗原、抗体等生物试剂产品,可以为您提供专业的技术服务,以优良的价格、优质的服务、优先的理念,满足客户的各方面的需求,与国内多家企业、单位建立了良好的长期合作关系,拥有较好的企业信誉和品牌形象。
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产品说明

特别提示:包括TaqMan microRNA反转录试剂盒在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!


产品名称:TaqMan microRNA反转录试剂盒
英文名称:TaqMan microRNA cDNA Synthesis Kit
产品货号:MT0006
产品规格:25T|100T

TaqMan miRNA反转录试剂盒采用加A法进行反转录,加A法的反转录效率远高于茎环法,因此,采用该方法可极大的提高检测灵敏度。该试剂盒操作简单,仅需要两步即可轻松完成miRNA的cDNA合成,合成的cDNA可用于所有miRNA的后续定量检测。TaqMan miRNA反转录试剂盒专用于miRNAs分子的反转录试验,转录获得的cDNA产物用于TaqMan定量PCR方法检测miRNAs分子(仅适用于Biorab TaqMan miRNA定量PCR试剂盒,货号:MTTxxxxx)。

TaqMan miRNA反转录试剂盒原理图
TaqMan miRNA反转录试剂盒原理图

产品组成:
组分 MT0006(25T) MT0006(100T)
5×TaqMan miRNA RT Solution A 25μl 100μl
10×TaqMan miRNA RT Solution B 50μl 200μl
10×TaqMan miRNA RT Primer 50μl 200μl
RNase Free H2O 1ml 1ml×2


储存:请置于-20℃,可保存2年;避免反复冻融。

操作方法:
1.按以下组分在0.2ml EP管中配制应液:
  miRNA(5~100 ng/μl)————————————4μl
  5×TaqMan miRNA RT Solution A—————————1μl注意:不建议使用Total RNA,Total RNA 试验结果通常差于miRNA。
2.在PCR 仪上按以下条件进行加 A 反应:
  37℃———————30分钟
  85℃———————5分钟
3.反应完毕后,在上述5μl 反应体系中加入如下试剂,并混合均匀。
  10×TaqMan miRNA RT Primer—————————2μl
  10×TaqMan miRNA RT Solution B———————2μl
  H2O————————————————————11μl
4.在PCR 仪上按以下条件进行反转录反应:
  30℃———————5分钟
  55℃———————60min
  95℃———————5分钟
获得的cDNA 产物可用于多个目标 miRNA的检测。反转录完毕后获得的miRNA cDNA,可加入20~80μl ddH20 稀释2~5 倍,通常取2μl即可用于 TaqMan miRNA 定量 PCR 试剂盒检测(货号:MTTxxxxx,该试剂盒有一万余种,详细列表可查询 TaqMan miRNA qPCR kit.xls)。
5.利用TaqMan qPCR Kit 对上述miRNA cDNA 产物进行 RealTime PCR 检测。

根据您的关注的TaqMan microRNA反转录试剂盒,TaqMan microRNA反转录试剂盒,MT0006,百奥莱博,,,您可能还对以下产品有需求:


ZN0068 Annexin IV mRNA原位杂交试剂盒 100T
ZN0074 APCDD1 mRNA原位杂交试剂盒 100T
ZN0180 CAMK 2b mRNA原位杂交试剂盒 100T
ZN0296 Claudin-6 mRNA原位杂交试剂盒 100T
ZN0374 Cytochrome Oxidase Subunit2 mRNA原位杂交试剂盒 100T
ZN0606 GP91-PHOX mRNA原位杂交试剂盒 100T
ZN0661 HMGA2 mRNA原位杂交试剂盒 100T
ZN0762 Interleukin 10/IL-10 mRNA原位杂交试剂盒 100T

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名称:ADM mRNA原位杂交试剂盒
货号:ZN0029
规格:100T
基本信息:
保存条件:4℃保存一年
工作量:100张切片。
有效期:一年。
适用种属:human,rat,mouse
标记方式:3’—尾段标记
试剂盒中内容:
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml;
2.预杂交液 2ml;
3.ADM mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml;
4.封闭液 5ml;
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml;
6.SABC-POD 5ml;
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂:
原位杂交专用盖玻片;POLY-L-LYSINE;DEPC;20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC,0.5×SSC,0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一.培养细胞和冰冻切片
准备工作:
固定液:4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6);1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g,柠檬酸三钠(C6H5O7Na3?2H2O,分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序:
注意:zuì重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
二.石蜡切片
如果有条件的话,应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后,及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6),含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块,固定1小时即可,较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感,如动物大脑,固定时间30-40分钟,一般不要超过1小时。
1.常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。
3.石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间,例如5分钟,10分钟,20分钟,30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察:
ADM的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项:
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数,加上基因仅由四个碱基排列组合而成,因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照,基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时,用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释,一般稀释2—10倍;并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况;如果出现大量的细胞核着色,往往和标本固定时间过长有关,应重新处理标本。

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